Zahvaljujemo se vam za obisk www.chinacdoe.com.Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS.Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju).Da bi zagotovili nadaljnjo podporo, bomo medtem spletno mesto upodobili brez slogov in JavaScripta.
Sistemi laboratorij na čipu z zmogljivostmi na kraju samem ponujajo možnost hitre in natančne diagnoze in so uporabni v okoljih z omejenimi viri, kjer ni na voljo biomedicinske opreme in usposobljenih strokovnjakov.Vendar ostaja velik izziv ustvarjanje sistema za testiranje na mestu oskrbe, ki ima hkrati vse potrebne funkcije za večnamensko razdeljevanje, sprostitev na zahtevo, zanesljivo delovanje in dolgoročno shranjevanje reagentov.Tukaj opisujemo tehnologijo mikro potovalnega stikala, ki se aktivira z ročico, ki lahko manipulira s tekočinami v kateri koli smeri, zagotavlja natančen in sorazmeren odziv na uporabljeni zračni tlak in ostane stabilen pred nenadnimi premiki in vibracijami.Na podlagi tehnologije opisujemo tudi razvoj sistema verižne reakcije s polimerazo, ki združuje vnos reagenta, mešanje in reakcijske funkcije v enem procesu, ki dosega delovanje »vzorec-v-odgovor-izhod« za vse klinične nazalne vzorce 18 bolnikov z Influenca in 18 posameznih kontrol, v dobri skladnosti intenzivnosti fluorescence s standardno verižno reakcijo s polimerazo (Pearsonovi koeficienti > 0,9).Na podlagi tehnologije opisujemo tudi razvoj sistema verižne reakcije s polimerazo, ki združuje vnos reagenta, mešanje in reakcijske funkcije v enem procesu, ki dosega delovanje "vzorec-v-odgovor-izhod" za vse klinične nazalne vzorce 18 bolnikov z gripo in 18 posameznimi kontrolami, v dobri skladnosti intenzivnosti fluorescence s standardno verižno reakcijo s polimerazo (Pearsonovi koeficienti > 0,9).Osnova te tehnologije, prav tako opisujemo razvoj sistema polimerazne reakcije, ki povezuje funkcije vnosa reagentov, mešanja in reakcij v enem procesu, ki zagotavlja izvedbo «obrazca-v-odgovor-izhod» za vse klinične vzorce iz nosu 18 bolnikov z Grippom. in 18 posameznih kontrol, ki so v dobrem skladu z intenzivnostjo fluorescencije s standardno polimerazno cepno reakcijo (Pirsonov koeficient> 0,9).Na podlagi te tehnologije opisujemo tudi razvoj sistema verižne reakcije s polimerazo, ki združuje funkcije vbrizgavanja, mešanja in reagiranja v enem samem procesu, kar omogoča vzorčenje v odzivu za vse klinične nazalne vzorce 18 bolnikov z gripo.in 18 posameznih kontrol, kar se dobro ujema s standardno intenzivnostjo fluorescence verižne reakcije s polimerazo (Pearsonovi koeficienti > 0,9).Na podlagi te tehnologije opisujemo tudi razvoj sistema verižne reakcije s polimerazo, ki združuje funkcije vbrizgavanja, mešanja in reakcije reagenta za analizo vseh kliničnih nosnih vzorcev iz 18 vzorčnih vzorcev iz nosu bolnikov. Gripa in 18 posameznih kontrol, intenziteta fluorescence se ujema dobro s standardno verižno reakcijo s polimerazo (Pearsonov koeficient > 0,9).Predlagana platforma zagotavlja zanesljivo avtomatizacijo biomedicinskih analiz in tako lahko pospeši komercializacijo vrste naprav za testiranje na kraju samem.
Nastajajoče človeške bolezni, kot je pandemija COVID-19 leta 2020, ki je zahtevala življenja milijonov ljudi, predstavljajo resno grožnjo globalnemu zdravju in človeški civilizaciji1.Zgodnje, hitro in natančno odkrivanje bolezni je ključnega pomena za nadzor nad širjenjem virusa in izboljšanje rezultatov zdravljenja.Osnovni diagnostični ekosistem, ki temelji na centraliziranih laboratorijih, kjer se testni vzorci pošiljajo v bolnišnice ali diagnostične klinike in jih vodijo strokovnjaki, trenutno omejuje dostop za skoraj 5,8 milijarde ljudi po vsem svetu, zlasti tistih, ki živijo v okoljih z omejenimi viri.kjer primanjkuje drage biomedicinske opreme in usposobljenih strokovnjakov.2. Zato je nujno treba razviti poceni in uporabniku prijazen sistem laboratorija na čipu z zmogljivostjo testiranja na kraju samem (POCT), ki lahko kliničnim zdravnikom zagotovi pravočasne diagnostične informacije za sprejemanje informiranih odločitev o diagnozi. .in zdravljenje 3.
Smernice Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) navajajo, da mora biti idealen POCT cenovno dostopen, uporabniku prijazen (preprost za uporabo z minimalnim usposabljanjem), natančen (izogibati se lažno negativnim ali lažno pozitivnim rezultatom), hiter in zanesljiv (zagotavljati dobre lastnosti ponovljivosti) in dostavljiv (sposoben dolgoročnega shranjevanja in takoj na voljo končnim uporabnikom)4.Da bi izpolnili te zahteve, morajo sistemi POCT zagotavljati naslednje funkcije: vsestransko doziranje za zmanjšanje ročnega posega, sproščanje reagenta v merilo na zahtevo za natančne rezultate testiranja in zanesljivo delovanje, ki vzdrži okoljske vibracije.Trenutno je najpogosteje uporabljena naprava POCT stranski pretočni trak5,6, ki je sestavljen iz več plasti poroznih nitroceluloznih membran, ki potisnejo zelo majhno količino vzorca naprej, pri čemer s kapilarno silo reagirajo s predhodno imobiliziranimi reagenti.Čeprav imajo prednosti nizkih stroškov, enostavne uporabe in hitrih rezultatov, se naprave POCT na osnovi pretočnih trakov lahko uporabljajo samo za biološke teste (npr. teste glukoze7,8 in teste nosečnosti9,10) brez potrebe po večstopenjskih analizah.reakcije (npr. nalaganje več reagentov, mešanje, multipleksiranje).Poleg tega gonilne sile, ki nadzorujejo gibanje tekočine (tj. kapilarne sile), ne zagotavljajo dobre konsistence, zlasti med serijami, kar ima za posledico slabo ponovljivost11 in zaradi česar so pasovi stranskega toka uporabni predvsem za dobro odkrivanje12,13.
Razširjene proizvodne zmogljivosti na mikro in nanometru so ustvarile priložnosti za razvoj mikrofluidnih naprav POCT za kvantitativne meritve14,15,16,17.S prilagajanjem lastnosti vmesnika 18, 19 in geometrije kanalov 20, 21, 22 je mogoče nadzorovati kapilarno silo in hitrost pretoka teh naprav.Vendar njihova zanesljivost, zlasti za močno namočene tekočine, ostaja nesprejemljiva zaradi proizvodnih netočnosti, napak v materialu in občutljivosti na okoljske vibracije.Poleg tega, ker se na meji tekočina-plin ustvari kapilarni tok, dodatnega toka ni mogoče uvesti, zlasti po polnjenju mikrofluidnega kanala s tekočino.Zato je treba za kompleksnejšo detekcijo izvesti več korakov vbrizgavanja vzorca24,25.
Med mikrofluidnimi napravami so centrifugalne mikrofluidne naprave trenutno ena najboljših rešitev za POCT26,27.Prednost njegovega pogonskega mehanizma je, da je pogonsko silo mogoče nadzorovati s prilagajanjem hitrosti vrtenja.Pomanjkljivost pa je, da je centrifugalna sila vedno usmerjena proti zunanjemu robu naprave, zaradi česar je težko izvajati večstopenjske reakcije, potrebne za bolj zapletene analize.Čeprav so dodatne pogonske sile (npr. kapilare 28, 29 in številne druge 30, 31, 32, 33, 34, 35) poleg centrifugalne sile uvedene za večnamensko doziranje, lahko še vedno pride do nepredvidenega prenosa tekočine, ker so te dodatne sile na splošno ukazi velikosti nižje od centrifugalne sile, zaradi česar so učinkoviti samo v majhnih delovnih območjih ali niso na voljo na zahtevo s sproščanjem tekočine.Vključevanje pnevmatskih manipulacij v centrifugalno mikrofluidiko, kot so centrifugalne kinetične metode 36, 37, 38, termopnevmatske metode 39 in aktivne pnevmatske metode 40, se je izkazalo za privlačno alternativo.S protifugodinamičnim pristopom so v napravo integrirana dodatna votlina in povezovalni mikrokanali za zunanje in notranje delovanje, čeprav je njena učinkovitost črpanja (v območju od 75 % do 90 %) močno odvisna od števila ciklov črpanja in viskoznosti. tekočine.Pri termopnevmatski metodi sta membrana iz lateksa in komora za prenos tekočine posebej zasnovani za tesnjenje ali ponovno odpiranje dovoda, ko se prostornina ujetega zraka segreje ali ohladi.Vendar pa nastavitev ogrevanja/hlajenja povzroča težave s počasnim odzivom in omejuje njeno uporabo pri termosenzibilnih testih (npr. pomnoževanje verižne reakcije s polimerazo (PCR)).Z aktivnim pnevmatskim pristopom se sprostitev na zahtevo in premikanje navznoter dosežeta s hkratno uporabo pozitivnega tlaka in natančno usklajenih vrtilnih hitrosti motorjev z visoko hitrostjo.Obstajajo tudi drugi uspešni pristopi, ki uporabljajo samo pnevmatske aktuatorje (pozitiven tlak 41, 42 ali negativni tlak 43) in zasnove normalno zaprtih ventilov.Z zaporednim pritiskanjem v pnevmatski komori se tekočina črpa peristaltično naprej, normalno zaprt ventil pa preprečuje povratni tok tekočine zaradi peristaltike, s čimer se izvajajo kompleksne tekočinske operacije.Vendar pa trenutno obstaja le omejeno število mikrofluidnih tehnologij, ki lahko izvajajo zapletene tekočinske operacije v eni napravi POCT, vključno z večnamenskim razdeljevanjem, sproščanjem na zahtevo, zanesljivim delovanjem, dolgoročnim shranjevanjem, ravnanjem z visoko viskoznimi tekočinami, in stroškovno učinkovito proizvodnjo.Vse hkrati.Pomanjkanje večstopenjskega funkcionalnega delovanja je lahko tudi eden od razlogov, zakaj je bilo do danes na odprtem trgu uspešno predstavljenih le nekaj komercialnih izdelkov POCT, kot so Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat in Rhonda.
V tem prispevku predlagamo pnevmatski mikrofluidni aktuator, ki temelji na tehnologiji mikro stikala zelenega obroča (FAST).FAST združuje vse potrebne lastnosti hkrati za široko paleto reagentov od mikrolitrov do mililitrov.FAST je sestavljen iz elastičnih membran, vzvodov in blokov.Brez uporabe zračnega pritiska je mogoče membrane, vzvode in bloke tesno zapreti, tekočino v notranjosti pa hraniti dolgo časa.Ko se uporabi ustrezen pritisk in prilagodi dolžini ročice, se diafragma razširi in potisne ročico v odprt položaj, kar omogoča prehajanje tekočine.To omogoča večnamensko odmerjanje tekočin na kaskadni, simultani, zaporedni ali selektivni način.
Razvili smo sistem PCR z uporabo FAST za ustvarjanje rezultatov odziva v vzorcu za odkrivanje virusov influence A in B (IAV in IBV).Dosegli smo spodnjo mejo detekcije (LOD) 102 kopij/ml, naš multipleksni test je pokazal specifičnost za IAV in IBV ter omogočil patotipizacijo virusa influence.Rezultati kliničnega testiranja z vzorcem nosnega brisa 18 bolnikov in 18 zdravih posameznikov kažejo dobro skladnost intenzivnosti fluorescence s standardno RT-PCR (Pearsonovi koeficienti > 0,9).Rezultati kliničnega testiranja z vzorcem nosnega brisa 18 bolnikov in 18 zdravih posameznikov kažejo dobro skladnost intenzivnosti fluorescence s standardno RT-PCR (Pearsonovi koeficienti > 0,9).Rezultati kliničnih poskusov z uporabo vzorca mazke iz nosu pri 18 bolnikih in 18 zdravih osebah kažejo dobro ustreznost intenzivnosti fluorescencije standardnega OT-PCR (Pirsonov koeficient > 0,9).Rezultati kliničnih preskušanj z vzorcem nosnega brisa 18 bolnikov in 18 zdravih posameznikov kažejo dobro ujemanje med intenzivnostjo fluorescence standardne RT-PCR (Pearsonovi koeficienti > 0,9).0,9)..................... Rezultati kliničnih poskusov z uporabo vzorcev nazalnih mazkov pri 18 bolnikih in 18 zdravih osebah so pokazali dobro skladnost med intenzivnostjo fluorescencije in standardnim OT-PCR (Pirsonov koeficient > 0,9).Rezultati kliničnih preskušanj z uporabo vzorcev nosnih brisov 18 bolnikov in 18 zdravih posameznikov so pokazali dobro ujemanje med intenzivnostjo fluorescence in standardno RT-PCR (Pearsonov koeficient > 0,9).Ocenjeni stroški materiala za napravo FAST-POCT so približno 1 USD (dodatna tabela 1) in jih je mogoče dodatno znižati z uporabo proizvodnih metod velikega obsega (npr. brizganje).Pravzaprav imajo naprave POCT, ki temeljijo na FAST, vse potrebne funkcije, ki jih predpisuje WHO, in so združljive z novimi metodami biokemičnega testiranja, kot so plazemsko termično kroženje44, imunski testi brez pomnoževanja45 in testi funkcionalizacije nanoteles46, ki so hrbtenica sistemov POCT.možnost.
Na sl.Slika 1a prikazuje strukturo platforme FAST-POCT, ki je sestavljena iz štirih tekočinskih komor: predskladiščne komore, mešalne komore, reakcijske komore in komore za odpadke.Ključ do nadzora pretoka tekočine je zasnova FAST (sestavljena iz elastičnih membran, vzvodov in blokov), ki se nahaja v komori pred shranjevanjem in mešalni komori.Kot pnevmatsko aktivirana metoda zasnova FAST zagotavlja natančen nadzor pretoka tekočine, vključno s preklapljanjem zaprto/odprto, vsestransko doziranje, sproščanje tekočine na zahtevo, zanesljivo delovanje (npr. neobčutljivost na vibracije iz okolja) in dolgoročno shranjevanje.Platforma FAST-POCT je sestavljena iz štirih plasti: oporne plasti, plasti elastične folije, plasti plastične folije in pokrivne plasti, kot je prikazano v povečanem pogledu na sliki 1b (podrobno prikazano tudi na dodatnih slikah S1 in S2 ).Vsi kanali in komore za transport tekočine (kot so komore za predshranjevanje in reakcijske komore) so vdelane v substrate PLA (polimlečne kisline) v debelini od 0,2 mm (najtanjši del) do 5 mm.Elastični filmski material je 300 µm debel PDMS, ki se zlahka razširi ob uporabi zračnega tlaka zaradi svoje "tanke debeline" in nizkega modula elastičnosti (približno 2,25 MPa47).Plast polietilenske folije je izdelana iz polietilen tereftalata (PET) debeline 100 µm za zaščito elastične folije pred prekomerno deformacijo zaradi zračnega pritiska.V skladu s komorami ima substratni sloj vzvode, povezane s pokrivnim slojem (iz PLA) s tečaji za nadzor pretoka tekočine.Elastični film je bil prilepljen na nosilno plast z dvostranskim lepilnim trakom (ARseal 90880) in prekrit s plastično folijo.Tri plasti so bile sestavljene na substrat z uporabo T-sponke v pokrivni plasti.T-objemka ima režo med dvema krakoma.Ko je bila sponka vstavljena v utor, sta se obe nogi rahlo upognili, nato pa sta se vrnili v prvotno stanje in tesno vezali pokrov in podlago, ko sta šli skozi utor (dodatna slika S1).Štiri plasti se nato sestavijo s pomočjo konektorjev.
Shematski diagram platforme, ki prikazuje različne funkcionalne predelke in funkcije FAST.b Povečan diagram platforme FAST-POCT.c Fotografija ploščadi poleg kovanca za četrt dolarja.
Delovni mehanizem platforme FAST-POCT je prikazan na sliki 2. Ključni sestavni deli so bloki na osnovnem sloju in tečaji na krovnem sloju, kar ima za posledico interferenčno zasnovo, ko so štirje sloji sestavljeni z uporabo T-oblike. .Ko ni zračnega pritiska (sl. 2a), interferenčno prileganje povzroči, da se tečaj upogne in deformira, skozi vzvod pa deluje tesnilna sila, ki pritisne elastični film na blok, in tekočina v tesnilni votlini je definirana kot zaprto stanje.Upoštevati je treba, da je v tem stanju vzvod upognjen navzven, kot je prikazano v stranskem pogledu na sliki 2a.Ko je doveden zrak (slika 2b), se elastična membrana razširi navzven proti pokrovu in potisne ročico navzgor ter tako odpre režo med ročico in blokom za pretok tekočine v naslednjo komoro, ki je definirana kot odprto stanje .Po sprostitvi zračnega pritiska se lahko ročica vrne v prvotni položaj in zaradi elastičnosti tečaja ostane tesna.Videoposnetki gibanja ročice so predstavljeni v dodatnem filmu S1.
A. Shematski diagram in fotografije v zaprtem stanju.V odsotnosti tlaka vzvod pritisne membrano proti bloku in tekočina je zaprta.b V dobrem stanju.Ob pritisku se membrana razširi in potisne vzvod navzgor, tako da se kanal odpre in tekočina lahko teče.c Določite karakteristično velikost kritičnega tlaka.Karakteristične mere so dolžina vzvoda (L), razdalja med drsnikom in tečajem (l) in debelina izbokline vzvoda (t).Fs je sila zbijanja na točki plina B. q je enakomerno porazdeljena obremenitev na vzvodu.Tx* predstavlja navor, ki ga razvije zgibna ročica.Kritični tlak je tlak, ki je potreben za dvig ročice in zagotovitev pretoka tekočine.d Teoretični in eksperimentalni rezultati razmerja med kritičnim tlakom in velikostjo elementa.n = 6 neodvisnih poskusov je bilo izvedenih in podatki so prikazani kot ± standardna deviacija.Neobdelani podatki so predstavljeni kot datoteke neobdelanih podatkov.
Razvit je bil analitični model, ki temelji na teoriji žarkov za analizo odvisnosti kritičnega tlaka Pc, pri katerem se reža odpre, od geometrijskih parametrov (na primer L je dolžina vzvoda, l je razdalja med blokom in tečaj, S je vzvod. Stična površina s tekočino t je debelina štrline vzvoda, kot je prikazano na sliki 2c).Kot je podrobno opisano v dodatnih opombah in dodatni sliki S3, se vrzel odpre, ko \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), kjer je Fs navor \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\), da odpravite sile, povezane z interferenčnim prileganjem, in povzročite upogibanje tečaja.Eksperimentalni odziv in analitični model se dobro ujemata (slika 2d), kar kaže, da kritični tlak Pc narašča z naraščanjem t/l in zmanjševanjem L, kar je enostavno razložiti s klasičnim modelom žarka, tj. navor narašča s t /Lift .Tako naša teoretična analiza jasno kaže, da je kritični tlak mogoče učinkovito nadzorovati s prilagajanjem dolžine vzvoda L in razmerja t/l, kar predstavlja pomembno osnovo za zasnovo platforme FAST-POCT.
Platforma FAST-POCT zagotavlja večnamensko doziranje (prikazano na sliki 3a z vstavkom in poskusom), kar je najpomembnejša lastnost uspešnega POCT, kjer lahko tekočine tečejo v kateri koli smeri in v katerem koli vrstnem redu (kaskadno, sočasno, zaporedno) ali selektivno večkanalno. doziranje .– funkcija doziranja.Na sl.3a(i) prikazuje kaskadni način doziranja, v katerem sta dve ali več komor kaskadno razvrščeni z uporabo blokov za ločevanje različnih reaktantov in vzvoda za nadzor odprtega in zaprtega stanja.Pri pritisku tekočina teče iz zgornje v spodnjo komoro kaskadno.Upoštevati je treba, da se kaskadne komore lahko napolnijo z mokrimi ali suhimi kemikalijami, kot so liofilizirani praški.V poskusu na sliki 3a(i) rdeče črnilo iz zgornje komore teče skupaj z modrim barvilom v prahu (bakrov sulfat) v drugo komoro in se obarva temno modro, ko doseže spodnjo komoro.Prikazuje tudi krmilni tlak za črpano tekočino.Podobno, ko je ena ročica povezana z dvema komorama, postane način sočasnega vbrizgavanja, kot je prikazano na sl.3a(ii), v kateri se lahko tekočina pod pritiskom enakomerno porazdeli po dveh ali več komorah.Ker je kritični tlak odvisen od dolžine vzvoda, se lahko dolžina vzvoda prilagodi, da se doseže vzorec zaporednega vbrizgavanja, kot je prikazano na sl.3a(iii).Dolga ročica (s kritičnim tlakom Pc_long) je bila povezana s komoro B, kratka ročica (s kritičnim tlakom Pc_short > Pc_long) pa je bila povezana s komoro A. Ker je bil uporabljen tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), je bila samo tekočina v rdeči barvi. lahko teče v komoro B in ko je bil tlak povečan na P2 (> Pc_short), lahko modra tekočina teče v komoro A. Ta način zaporednega vbrizgavanja velja za različne tekočine, ki se zaporedno prenašajo v svoje povezane komore, kar je ključnega pomena za uspešno POCT napravo.Dolga ročica (s kritičnim tlakom Pc_long) je bila povezana s komoro B, kratka ročica (s kritičnim tlakom Pc_short > Pc_long) pa je bila povezana s komoro A. Ker je bil uporabljen tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), je bila samo tekočina v rdeči barvi. lahko teče v komoro B in ko je bil tlak povečan na P2 (> Pc_short), lahko modra tekočina teče v komoro A. Ta način zaporednega vbrizgavanja velja za različne tekočine, ki se zaporedno prenašajo v svoje povezane komore, kar je ključnega pomena za uspešno POCT napravo.Dolžina (s kritičnim pritiskom Pc_long) je bila povezana s kamero B, kratek palec (s kritičnim pritiskom Pc_short > Pc_long) je bil povezan s kamero A. Pri priloženem pritisku P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) je samo tekočina, izbrana rdeča lahko teče v kamero B, in ko je bil pritisk povečan na P2 (> Pc_short), sinja tekočina lahko teče v kameri A. Ta način zaporednega vnosa se uporablja za različne tekočine, ki se zaporedno premikajo v druge kamere, kar ima odločilno vrednost za uspešno POCT.Dolga ročica (s kritičnim tlakom Pc_long) je bila povezana s komoro B, kratka ročica (s kritičnim tlakom Pc_short > Pc_long) pa je bila povezana s komoro A. Ko je uporabljen tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), je označena samo tekočina v rdeči barvi lahko teče v komoro B, in ko se tlak poveča na P2 (> Pc_short), lahko modra tekočina teče v komoro A. Ta način zaporednega vbrizgavanja se uporablja za različne tekočine, ki se zaporedno prenašajo v ustrezne komore, kar je kritično za uspešno POCT.napravo. Dolžina (kritični pritisk Pc_long) je povezana s kamero B, kratek ryčag (kritični pritisk Pc_short > Pc_long) pa je povezana s kamero A.Dolga roka (kritični tlak Pc_long) je povezana s komoro B, kratka roka (kritični tlak Pc_short > Pc_long) pa s komoro A.Pri priloženem tlaku P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) v kameri B lahko deluje samo rdeča tekočina, a pri povečanem tlaku do P2 (> Pc_short) v kameri A lahko deluje sinja tekočina.Ko je uporabljen tlak P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), lahko v komoro B vstopi samo rdeča tekočina, in ko se tlak poveča na P2 (> Pc_short), lahko modra tekočina vstopi v komoro A. Ta način zaporednega vbrizgavanja je primeren za zaporedni prenos različne tekočine v ustrezne komore, kar je ključnega pomena za uspešno delovanje naprave POCT.Slika 3a(iv) prikazuje selektivni način vbrizgavanja, kjer je imela glavna komora kratko (s kritičnim tlakom Pc_short) in dolgo ročico (s kritičnim tlakom Pc_long < Pc_short), ki sta bila poleg tega povezana s komoro A oziroma B v drug zračni kanal, povezan s komoro B. Za prenos tekočine najprej v komoro A sta bila na napravo istočasno uporabljena tlaka P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) in P2 (P2 > P1) s P1 + P2 > Pc_short.Slika 3a(iv) prikazuje selektivni način vbrizgavanja, kjer je imela glavna komora kratko (s kritičnim tlakom Pc_short) in dolgo ročico (s kritičnim tlakom Pc_long < Pc_short), ki sta bila poleg tega povezana s komoro A oziroma B v drug zračni kanal, povezan s komoro B. Za prenos tekočine najprej v komoro A sta bila na napravo istočasno uporabljena tlaka P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) in P2 (P2 > P1) s P1 + P2 > Pc_short.Na sl.3a(iv) prikazan način selektivnega vklopa, pri katerem je osnovna kamera imela kratko (s kritičnim pritiskom Pc_short) in daljši ryčag (s kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short), ki sta bila ustrezno povezana s kamero A in kamero B.3a (iv) prikazuje selektivni način vbrizgavanja, pri katerem je imela glavna komora kratko (s kritičnim tlakom Pc_short) in dolgo ročico (s kritičnim tlakom Pc_long < Pc_short), ki sta bili dodatno povezani s komoro A oziroma komoro B.k drugemu zračnemu kanalu, ki je povezan s kamero B. Če želite najprej prenesti tekočino v kamero A, k napravi hkrati prilagodite pritisk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) in P2 (P2 > P1), kjer P1 + P2 > Pc_short.na drug zračni kanal, povezan s komoro B. Za prvi prenos tekočine v komoro A sta bila na napravo hkrati uporabljena tlaka P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) in P2 (P2 > P1), kjer je P1 + P2 > Pc_short. 3a(iv) prikazan režim selektivnega vklopa, ko ima osnovna kamera kratek nagib (s kritičnim pritiskom Pc_short) in dolg nagib (s kritičnim pritiskom Pc_long < Pc_short), povezane s kamero A in kamero B v skladu s tem in v dopolnitvi z drugim zračnim kanalom, priključenному к комнате B.3a(iv) prikazuje način selektivnega vbrizgavanja, ko ima glavna komora kratko steblo (kritični tlak Pc_short) in dolgo steblo (kritični tlak Pc_long < Pc_short), povezano s komoro A oziroma komoro B, in poleg drugega zračnega prehoda, povezan s sobo B.Tako P2 preprečuje vstop tekočine v komoro B;medtem je skupni tlak P1 + P2 presegel kritični tlak za aktiviranje krajšega vzvoda, povezanega s komoro A, da se omogoči pretok tekočine v komoro A. Potem, ko je bilo treba komoro B napolniti, moramo uporabiti samo P1 (Pc_long < P1 < Pc_kratek) v glavni komori, da se aktivira dolgi vzvod in omogoči, da tekočina teče v komoro B. Od časa t = 3 s do 9 s je mogoče jasno opaziti, da je tekočina v komori A ostala konstantna, medtem ko se je v komori povečala B, ko je bil uporabljen tlak P1.medtem je skupni tlak P1 + P2 presegel kritični tlak za aktiviranje krajšega vzvoda, povezanega s komoro A, da se omogoči pretok tekočine v komoro A. Potem, ko je bilo treba komoro B napolniti, moramo uporabiti samo P1 (Pc_long < P1 < Pc_kratek) v glavni komori, da se aktivira dolgi vzvod in omogoči, da tekočina teče v komoro B. Od časa t = 3 s do 9 s je mogoče jasno opaziti, da je tekočina v komori A ostala konstantna, medtem ko se je v komori povečala B, ko je bil uporabljen tlak P1.Med tem je skupni pritisk P1 + P2 povečal kritičen pritisk, da bi aktivirali krajši zagon, povezan s kamero A, da bi omogočili tekočino v kameri A. Nato, ko je potrebno zapolniti kamero B, moramo samo uporabiti P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) v osnovni kameri, če želite aktivirati dolg rychag in dati tekočino teči v kamero B. Lahko jasno opazujete, da je v obdobju s t = 3 s do 9 s tekočino v kameri A ostala konstantna, medtem ko se je v kameri povečala.Medtem je skupni tlak P1 + P2 presegel kritični tlak za aktiviranje krajšega vzvoda, povezanega s komoro A, ki omogoča pretok tekočine v komoro A. Potem, ko je treba komoro B napolniti, moramo uporabiti samo P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) v glavni komori, da aktivirate dolgo ročico in pustite, da tekočina teče v komoro B. Jasno je mogoče opaziti, da je med t = 3 s in 9 s tekočina v komori A ostala konstantna, v komori pa se je povečala.B, ko je uporabljen tlak P1.Hkrati skupni tlak P1 + P2 preseže kritični tlak, kar sproži krajši vzvod, ki povezuje komoro A, kar omogoča pretok tekočine v komoro A.Ko je čas za polnjenje komore A, preprosto nanesemo P1 v glavno komoro in P2 v sekundarno komoro.Na ta način je mogoče selektivno preklapljati med kamerama A in B. Obnašanje toka štirih večnamenskih načinov porazdelitve lahko najdete v dodatnem filmu S2.
a Ponazoritev večnamenskega dodeljevanja, tj. (i) kaskadno, (ii) sočasno, (iii) zaporedno in (iv) selektivno dodeljevanje.Krivulje predstavljajo potek dela in parametre teh štirih načinov distribucije.b Rezultati testov dolgoročnega shranjevanja v deionizirani vodi in etanolu.n = 5 neodvisnih poskusov je bilo izvedenih in podatki so prikazani kot ± sd c.Prikazi preskusa stabilnosti, ko sta bili naprava FAST in naprava s kapilarnim ventilom (CV) v (i) statičnem in (ii) vibrirajočem stanju.(iii) Volumen v odvisnosti od časa za naprave FAST in CV pri različnih kotnih frekvencah.d Objava rezultatov testiranja na zahtevo za (i) napravo FAST in (ii) napravo CV.(iii) Razmerje med prostornino in časom za naprave FAST in CV, ki uporabljajo način intermitentnega tlaka.Vse merilne palice, 1 cm.Neobdelani podatki so na voljo kot neobdelane podatkovne datoteke.
Dolgotrajno shranjevanje reagentov je še ena pomembna značilnost uspešne naprave POCT, ki bo neusposobljenemu osebju omogočila rokovanje z več reagenti.Medtem ko so številne tehnologije pokazale svoj potencial za dolgoročno shranjevanje (npr. 35 mikrodispenzerjev, 48 pakiranj v pretisnih omotih in 49 pakiranj v paličicah), je za namestitev paketa potreben namenski sprejemni predel, kar poveča stroške in kompleksnost;poleg tega ti mehanizmi za shranjevanje ne omogočajo razdeljevanja na zahtevo in povzročijo izgubo reagentov zaradi ostankov v embalaži.Zmogljivost dolgotrajnega shranjevanja je bila preverjena z izvedbo pospešenega preskusa življenjske dobe z uporabo materiala PMMA, obdelanega s CNC, zaradi njegove rahle hrapavosti in odpornosti na prepustnost plina (dodatna slika S5).Testni aparat je bil napolnjen z deionizirano vodo (deionizirana voda) in 70 % etanolom (simulacija hlapnih reagentov) pri 65 °C 9 dni.Tako deionizirana voda kot etanol sta bila shranjena z aluminijasto folijo, da bi preprečili dostop od zgoraj.Za izračun ekvivalenta v realnem času sta bili uporabljeni Arrheniusova enačba in aktivacijska energija prodora, navedena v literaturi50,51.Na sl.3b prikazuje povprečne rezultate izgube teže za 5 vzorcev, shranjenih pri 65 °C 9 dni, kar ustreza 0,30 % za deionizirano vodo in 0,72 % za 70 % etanol v 2 letih pri 23 °C.
Na sl.3c prikazuje preskus vibracij.Ker je kapilarni ventil (CV) najbolj priljubljena metoda ravnanja s tekočino med obstoječimi napravami POCT28,29, je bila za primerjavo uporabljena naprava CV širine 300 µm in globine 200 µm.Vidimo lahko, da ko obe napravi mirujeta, tekočina v platformi FAST-POCT tesni, tekočina v napravi CV pa se blokira zaradi nenadnega širjenja kanala, kar zmanjša kapilarne sile.Ko pa se kotna frekvenca orbitalnega vibratorja poveča, tekočina v platformi FAST-POCT ostane zaprta, vendar tekočina v napravi CV teče v spodnjo komoro (glejte tudi dopolnilni film S3).To nakazuje, da lahko deformabilni tečaji platforme FAST-POCT uporabijo močno mehansko silo na modulu, da tesno zaprejo tekočino v komori.Vendar pa se v napravah CV tekočina zadržuje zaradi ravnovesja med trdno, zračno in tekočo fazo, kar ustvarja nestabilnost, tresljaji pa lahko porušijo ravnovesje in povzročijo nepričakovano obnašanje toka.Prednost platforme FAST-POCT je, da zagotavlja zanesljivo delovanje in preprečuje okvare ob prisotnosti tresljajev, ki se običajno pojavijo med dostavo in delovanjem.
Druga pomembna lastnost platforme FAST-POCT je izdaja na zahtevo, kar je ključna zahteva za kvantitativno analizo.Na sl.3d primerja izdajo na zahtevo platforme FAST-POCT in naprave CV.Iz sl.3d(iii) vidimo, da se naprava FAST hitro odzove na tlačni signal.Ko je bil na platformo FAST-POCT uporabljen pritisk, je tekočina tekla, ko je bil tlak popuščen, se je tok takoj ustavil (slika 3d(i)).To dejanje je mogoče pojasniti s hitrim elastičnim vračanjem tečaja, ki pritisne vzvod nazaj proti bloku in zapre komoro.Vendar je tekočina še naprej tekla v napravi CV, kar je na koncu povzročilo nepričakovan volumen tekočine približno 100 µl po sprostitvi tlaka (slika 3d(ii) in dodatni film S4).To je mogoče razložiti z izginotjem učinka kapilarne zagozdenosti ob popolnem omočenju CV po prvem injiciranju.
Zmožnost ravnanja s tekočinami z različno omočljivostjo in viskoznostjo v isti napravi ostaja izziv za aplikacije POCT.Slaba omočljivost lahko povzroči puščanje ali drugo nepričakovano obnašanje toka v kanalih, zato je za pripravo visoko viskoznih tekočin pogosto potrebna pomožna oprema, kot so vrtinčni mešalniki, centrifuge in filtri 52 .Testirali smo razmerje med kritičnim tlakom in lastnostmi tekočine (s širokim razponom omočljivosti in viskoznosti).Rezultati so prikazani v tabeli 1 in videu S5.Vidimo lahko, da lahko v komoro zapremo tekočine z različno omočljivostjo in viskoznostjo, pri pritisku pa lahko v sosednjo komoro prenesemo tudi tekočine z viskoznostjo do 5500 cP, kar omogoča zaznavanje vzorcev z visoko viskoznost (tj. sputum, zelo viskozen vzorec, ki se uporablja za diagnozo bolezni dihal).
S kombiniranjem zgornjih večnamenskih dozirnih naprav je mogoče razviti široko paleto naprav POCT na osnovi FAST.Primer je prikazan na sliki 1. Obrat vsebuje predshranjevalno komoro, mešalno komoro, reakcijsko komoro in komoro za odpadke.Reagente lahko dlje časa shranjujete v komori za predhodno shranjevanje in jih nato izpustite v mešalno komoro.S pravim tlakom je mogoče mešane reaktante selektivno prenesti v komoro za odpadke ali reakcijsko komoro.
Ker je odkrivanje PCR zlati standard za odkrivanje patogenov, kot sta H1N1 in COVID-19, in vključuje več reakcijskih korakov, smo kot aplikacijo uporabili platformo FAST-POCT za odkrivanje PCR.Na sl.4 prikazuje postopek PCR testiranja s platformo FAST-POCT.Najprej smo elucijski reagent, reagent z magnetnimi mikrokroglicami, raztopino za izpiranje A in raztopino za izpiranje W pipetirali v komore za predhodno shranjevanje E, M, W1 oziroma W2.Stopnje adsorpcije RNA so prikazane na sl.4a in sta naslednji: (1) ko se uporabi tlak P1 (=0,26 bara), se vzorec premakne v komoro M in se izprazni v mešalno komoro.(2) Zračni tlak P2 (= 0,12 bara) se dovaja skozi odprtino A, ki je povezana z dnom mešalne komore.Čeprav so številne metode mešanja pokazale svoj potencial pri mešanju tekočin na platformah POCT (npr. serpentinasto mešanje 53, naključno mešanje 54 in šaržno mešanje 55), njihova učinkovitost in uspešnost mešanja še vedno nista zadovoljivi.Uporablja metodo mešanja z mehurčki, pri kateri se na dno mešalne komore vnese zrak, da se v tekočini ustvarijo mehurčki, po katerih lahko močan vrtinec doseže popolno mešanje v nekaj sekundah.Izvedeni so bili poskusi mešanja mehurčkov, rezultati pa so predstavljeni na dodatni sliki S6.Vidimo lahko, da ob uporabi tlaka 0,10 bara popolno mešanje traja približno 8 sekund.S povečanjem tlaka na 0,20 bara je popolno mešanje doseženo v približno 2 sekundah.Metode za izračun učinkovitosti mešanja so predstavljene v razdelku Metode.(3) Z rubidijevim magnetom izvlecite kroglice, nato povečajte tlak P3 (= 0,17 bara) skozi odprtino P, da premaknete reagente v komoro za odpadke.Na sl.4b,c prikazuje korake pranja za odstranitev nečistoč iz vzorca, kot sledi: (1) Pralna raztopina A iz komore W1 se izprazni v tlačno mešalno komoro P1.(2) Nato izvedite postopek mešanja z mehurčki.(3) Pralna raztopina A se prenese v komoro za odpadno tekočino, mikrokroglice iz mešalne komore pa magnet izvleče.Pranje W (slika 4c) je bilo podobno pranju A (slika 4b).Opozoriti je treba, da je bil vsak korak pranja A in W izveden dvakrat.Slika 4d prikazuje korake eluiranja za eluiranje RNA iz kroglic;koraki eluiranja in mešanja so enaki kot zgoraj opisani koraki adsorpcije in pranja RNA.Ko se elucijski reagenti prenesejo v reakcijsko komoro PCR pod tlakoma P3 in P4 (=0,23 bara), je dosežen kritični tlak za tesnjenje kraka reakcijske komore PCR.Podobno tudi tlak P4 pomaga zapreti prehod v komoro za odpadke.Tako so bili vsi elucijski reagenti enakomerno porazdeljeni med štiri reakcijske komore PCR, da se sprožijo reakcije multipleksne PCR.Zgornji postopek je predstavljen v dodatnem filmu S6.
V koraku adsorpcije RNA se vzorec vnese v dovod M in vbrizga v mešalno komoro skupaj s predhodno shranjeno raztopino kroglic.Po mešanju in odstranitvi granul se reagenti porazdelijo v komoro za odpadke.koraka pranja b in c, v mešalno komoro vnesite različne vnaprej shranjene reagente za pranje in po mešanju in odstranitvi kroglic prenesite reagente v komoro za odpadno tekočino.d Korak eluiranja: Po vnosu elucijskih reagentov, mešanju in ekstrakciji kroglic se reagenti prenesejo v reakcijsko komoro PCR.Krivulje prikazujejo potek dela in povezane parametre različnih stopenj.Tlak je tlak, ki poteka skozi posamezne komore.Prostornina je prostornina tekočine v mešalni komori.Vse merilne palice so 1 cm.Neobdelani podatki so na voljo kot datoteke neobdelanih podatkov.
Izveden je bil postopek testiranja PCR in dopolnilna slika S7 predstavlja toplotne profile, vključno z 20 minutami časa povratne transkripcije in 60 minutami termičnega cikličnega časa (95 in 60 °C), pri čemer je en termični cikel 90 s (dodatni film S7)..FAST-POCT zahteva manj časa za dokončanje enega termičnega cikla (90 sekund) kot običajna RT-PCR (180 sekund za en termični cikel).To je mogoče razložiti z visokim razmerjem med površino in prostornino ter nizko toplotno vztrajnostjo reakcijske komore mikro-PCR.Površina komore je 96,6 mm2, prostornina komore pa 25 mm3, zaradi česar je razmerje med površino in prostornino približno 3,86.Kot je razvidno iz dodatne slike S10, ima območje testa PCR na naši platformi utor na hrbtni plošči, zaradi česar je dno komore PCR debelo 200 µm.Toplotno prevodna elastična blazinica je pritrjena na grelno površino temperaturnega regulatorja, kar zagotavlja tesen stik s hrbtno stranjo testne škatle.To zmanjša toplotno vztrajnost platforme in izboljša učinkovitost ogrevanja/hlajenja.Med termičnim kroženjem se parafin, vgrajen v ploščad, stopi in steče v reakcijsko komoro PCR ter deluje kot tesnilo za preprečevanje izhlapevanja reagenta in kontaminacije okolja (glejte dodatni film S8).
Vsi zgoraj opisani postopki odkrivanja PCR so bili popolnoma avtomatizirani z uporabo po meri izdelanega instrumenta FAST-POCT, ki je sestavljen iz programirane enote za nadzor tlaka, enote za magnetno ekstrakcijo, enote za nadzor temperature ter enote za zajemanje in obdelavo fluorescentnega signala.Omeniti velja, da smo uporabili platformo FAST-POCT za izolacijo RNA in nato uporabili ekstrahirane vzorce RNA za reakcije PCR z uporabo sistema FAST-POCT in namiznega sistema PCR za primerjavo.Rezultati so bili skoraj enaki, kot je prikazano na dodatni sliki S8.Operater opravi preprosto nalogo: vstavi vzorec v M-komoro in vstavi ploščad v instrument.Kvantitativni rezultati testa so na voljo v približno 82 minutah.Podrobne informacije o orodjih FAST-POCT najdete na dodatni sliki.C9, C10 in C11.
Gripa, ki jo povzročajo virusi influence A (IAV), B (IBV), C (ICV) in D (IDV), je pogost svetovni pojav.Od teh sta IAV in IBV odgovorna za najhujše primere in sezonske epidemije, ki okužita 5–15 % svetovnega prebivalstva, povzročita 3–5 milijonov hudih primerov in povzročita 290.000–650.000 smrti letno.Bolezni dihal56,57.Zgodnja diagnoza IAV in IB je bistvena za zmanjšanje obolevnosti in s tem povezanega gospodarskega bremena.Med razpoložljivimi diagnostičnimi tehnikami velja verižna reakcija polimeraze z reverzno transkriptazo (RT-PCR) za najbolj občutljivo, specifično in natančno (>99 %)58,59.Med razpoložljivimi diagnostičnimi tehnikami velja verižna reakcija polimeraze z reverzno transkriptazo (RT-PCR) za najbolj občutljivo, specifično in natančno (>99 %)58,59.Med dostopnimi diagnostičnimi metodami se polimerazna cepna reakcija z obratno transkriptazo (OT-PCR) šteje za najbolj občutljivo, specifično in natančno (> 99%)58,59.Med razpoložljivimi diagnostičnimi metodami velja verižna reakcija polimeraze z reverzno transkriptazo (RT-PCR) za najbolj občutljivo, specifično in natančno (> 99 %)58,59. Iz dostopnih diagnostičnih metod se polimerazna cepna reakcija z obratno transkriptazo (OT-PCR) šteje za najbolj občutljivo, specifično in natančno (>99%)58,59.Od razpoložljivih diagnostičnih metod velja verižna reakcija polimeraze z reverzno transkriptazo (RT-PCR) za najbolj občutljivo, specifično in natančno (>99 %)58,59.Vendar tradicionalne metode RT-PCR zahtevajo večkratno pipetiranje, mešanje, doziranje in prenos tekočine, kar omejuje njihovo uporabo s strani strokovnjakov v okoljih z omejenimi viri.Tu je bila uporabljena platforma FAST-POCT za PCR detekcijo IAV oziroma IBV, da bi dobili njihovo spodnjo mejo detekcije (LOD).Poleg tega sta bila IAV in IBV multipleksirana za razlikovanje med različnimi patotipi med vrstami, kar zagotavlja obetavno platformo za genetsko analizo in sposobnost natančnega zdravljenja bolezni.
Na sl.5a prikazuje rezultate HAV PCR testiranja z uporabo 150 µl prečiščene virusne RNA kot vzorca.Na sl.5a(i) kaže, da lahko pri koncentraciji HAV 106 kopij/ml intenzivnost fluorescence (ΔRn) doseže 0,830, in ko se koncentracija zmanjša na 102 kopije/ml, lahko ΔRn še vedno doseže 0,365, kar ustreza več kot prazne negativne kontrolne skupine (0,002), približno 100-krat večja.Za kvantifikacijo na podlagi šestih neodvisnih poskusov je bila ustvarjena linearna umeritvena krivulja med logaritemsko koncentracijo in pragom cikla (Ct) IAV (slika 5a(ii)), R2 = 0,993, v razponu od 102-106 kopij/ml.rezultati se dobro ujemajo z običajnimi metodami RT-PCR.Na sl.5a(iii) prikazuje fluorescentne slike rezultatov testa po 40 ciklih platforme FAST-POCT.Ugotovili smo, da lahko platforma FAST-POCT zazna HAV že pri 102 kopijah/ml.Vendar pa tradicionalna metoda nima vrednosti Ct pri 102 kopijah/mL, zaradi česar je LOD približno 103 kopij/mL.Domnevali smo, da je to morda posledica visoke učinkovitosti mešanja z mehurčki.Poskusi s testom PCR so bili izvedeni na prečiščeni IAV RNA za oceno različnih metod mešanja, vključno z mešanjem s stresanjem (ista metoda mešanja kot pri običajni operaciji RT-PCR), mešanjem v viali (ta metoda, 3 s pri 0,12 bara) in brez mešanja kot kontrolna skupina ..Rezultate lahko najdete na dodatni sliki S12.Vidimo lahko, da so pri višji koncentraciji RNA (106 kopij/mL) vrednosti Ct različnih metod mešanja skoraj enake kot pri mešanju z mehurčki.Ko je koncentracija RNK padla na 102 kopiji/ml, stresalna mešanica in kontrole niso imele vrednosti Ct, medtem ko je metoda mešanja z mehurčki še vedno dala vrednost Ct 36,9, kar je bilo pod pragom Ct 38. Rezultati kažejo prevladujočo karakteristiko mešanja veziklov, kar je bilo dokazano tudi v drugi literaturi, kar lahko tudi pojasni, zakaj je občutljivost platforme FAST-POCT nekoliko višja od običajne RT-PCR.Na sl.5b prikazuje rezultate PCR analize očiščenih vzorcev IBV RNA v razponu od 101 do 106 kopij/ml.Rezultati so bili podobni testu IAV, dosegli so R2 = 0,994 in LOD 102 kopije/ml.
analiza PCR virusa influence A (IAV) s koncentracijami IAV v razponu od 106 do 101 kopij/ml z uporabo pufra TE kot negativne kontrole (NC).(i) Krivulja fluorescence v realnem času.(ii) Linearna umeritvena krivulja med logaritemsko koncentracijo IAV RNA in pragom cikla (Ct) za FAST in običajne metode testiranja.(iii) Fluorescentna slika IAV FAST-POCT po 40 ciklih.b, PCR detekcija virusa influence B (IBV) z (i) spektrom fluorescence v realnem času.(ii) Linearna umeritvena krivulja in (iii) fluorescenčna slika FAST-POCT IBV po 40 ciklih.Spodnja meja detekcije (LOD) za IAV in IBV z uporabo platforme FAST-POCT je bila 102 kopiji/mL, kar je nižje od običajnih metod (103 kopije/mL).c Rezultati testa Multiplex za IAV in IBV.GAPDH je bil uporabljen kot pozitivna kontrola, pufer TE pa je bil uporabljen kot negativna kontrola, da se prepreči morebitna kontaminacija in pomnoževanje ozadja.Ločimo lahko štiri različne vrste vzorcev: (1) negativni vzorci samo za GAPDH (»IAV-/IBV-«);(2) okužba z IAV (»IAV+/IBV-«) z IAV in GAPDH;(3) okužba z IBV (»IAV-/IBV+«) z IBV in GAPDH;(4) Okužba z IAV/IBV (»IAV+/IBV+«) z IAV, IBV in GAPDH.Črtkana črta predstavlja črto praga.n = 6 biološko neodvisnih poskusov je bilo izvedenih, podatki so prikazani kot ± standardni odklon.Neobdelani podatki so predstavljeni kot datoteke neobdelanih podatkov.
Na sl.5c prikazuje rezultate testa multipleksiranja za IAV/IBV.Tukaj je bil kot vzorčna raztopina uporabljen virusni lizat namesto prečiščene RNA in štirje primerji za IAV, IBV, GAPDH (pozitivna kontrola) in pufer TE (negativna kontrola) so bili dodani v štiri različne reakcijske komore platforme FAST-POCT.Tukaj se uporabljajo pozitivne in negativne kontrole, da se prepreči morebitna kontaminacija in izboljšanje ozadja.Testi so bili razdeljeni v štiri skupine: (1) GAPDH-negativni vzorci (»IAV-/IBV-«);(2) okuženi z IAV (»IAV+/IBV-«) v primerjavi z IAV in GAPDH;(3) IBV-.okuženi (“IAV-”) -/IBV+”) IBV in GAPDH;(4) Okužba z IAV/IBV (»IAV+/IBV+«) z IAV, IBV in GAPDH.Na sl.Slika 5c kaže, da je bila pri uporabi negativnih vzorcev intenzivnost fluorescence ΔRn komore za pozitivno kontrolo 0,860, ΔRn IAV in IBV pa je bil podoben negativni kontroli (0,002).Za skupine IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ in IAV+/IBV+ so kamere IAV/GAPDH, IBV/GAPDH oziroma IAV/IBV/GAPDH pokazale znatno intenzivnost fluorescence, medtem ko so druge kamere celo pokazale intenzivnost fluorescence v ozadju raven 40 po termičnem ciklu.Iz zgornjih testov je platforma FAST-POCT pokazala izjemno specifičnost in nam je omogočila sočasno patotipiziranje različnih virusov gripe.
Da bi potrdili klinično uporabnost FAST-POCT, smo testirali 36 kliničnih vzorcev (vzorci brisa nosu) bolnikov z IB (n=18) in kontrolnih oseb brez IB (n=18) (slika 6a).Podatki o bolniku so predstavljeni v dodatni tabeli 3. Status okužbe z IB je bil neodvisno potrjen in protokol študije je odobrila Prva pridružena bolnišnica Zhejiang University (Hangzhou, Zhejiang).Vsak vzorec bolnikov je bil razdeljen v dve kategoriji.Ena je bila obdelana z uporabo FAST-POCT, druga pa z uporabo namiznega sistema PCR (SLAN-96P, Kitajska).Oba testa uporabljata iste komplete za čiščenje in odkrivanje.Na sl.Slika 6b prikazuje rezultate FAST-POCT in konvencionalne PCR z reverzno transkripcijo (RT-PCR).Primerjali smo intenzivnost fluorescence (FAST-POCT) z -log2(Ct), kjer je Ct prag cikla za konvencionalno RT-PCR.Obe metodi sta se dobro ujemali.FAST-POCT in RT-PCR sta pokazala močno pozitivno korelacijo z vrednostjo Pearsonovega razmerja (r) 0,90 (slika 6b).Nato smo ocenili diagnostično natančnost FAST-POCT.Porazdelitve intenzivnosti fluorescence (FL) za pozitivne in negativne vzorce so bile podane kot neodvisna analitska mera (slika 6c).Vrednosti FL so bile bistveno višje pri bolnikih z IB kot pri kontrolah (****P = 3,31 × 10-19; dvostranski t-test) (slika 6d).Nato so bile narisane krivulje delovanja sprejemnika IBV (ROC).Ugotovili smo, da je bila diagnostična natančnost zelo dobra, s površino pod krivuljo 1 (slika 6e).Upoštevajte, da zaradi obveznega naročanja mask na Kitajskem zaradi COVID-19 od leta 2020 nismo identificirali bolnikov s KVČB, zato so bili vsi pozitivni klinični vzorci (tj. vzorci nosnih brisov) samo za IBV.
Oblikovanje klinične študije.Skupaj 36 vzorcev, vključno z 18 vzorci bolnikov in 18 kontrolnimi skupinami brez gripe, je bilo analiziranih s platformo FAST-POCT in konvencionalno RT-PCR.b Ocenite analitično skladnost med FAST-POCT PCR in običajnim RT-PCR.Rezultati so bili v pozitivni korelaciji (Pearson r = 0,90).c Ravni intenzivnosti fluorescence pri 18 bolnikih z IB in 18 kontrolah.d Pri bolnikih z IB (+) so bile vrednosti FL bistveno višje kot v kontrolni skupini (-) (****P = 3,31 × 10-19; dvostranski t-test; n = 36).Za vsako kvadratno grafično črto črni označevalec na sredini predstavlja mediano, spodnja in zgornja črta polja pa predstavljata 25. oziroma 75. percentil.Brki segajo do najmanjših in največjih podatkovnih točk, ki se ne štejejo za izstopajoče.e ROC krivulja.Črtkana črta d predstavlja vrednost praga, ocenjeno iz analize ROC.AUC za IBV je 1. Neobdelani podatki so na voljo kot neobdelane podatkovne datoteke.
V tem članku predstavljamo FAST, ki ima lastnosti, potrebne za idealen POCT.Prednosti naše tehnologije vključujejo: (1) vsestransko doziranje (kaskadno, sočasno, zaporedno in selektivno), sproščanje na zahtevo (hitro in sorazmerno sproščanje uporabljenega tlaka) in zanesljivo delovanje (vibracije pri 150 stopinjah) (2) dolgoročno skladiščenje (2 leti pospešenega testiranja, izguba teže približno 0,3 %);(3) sposobnost dela s tekočinami s širokim razponom omočljivosti in viskoznosti (viskoznost do 5500 cP);(4) Ekonomičnost (Ocenjeni materialni stroški naprave FAST-POCT PCR so približno 1 USD).S kombinacijo multifunkcijskih dispenzerjev je bila prikazana in uporabljena integrirana platforma FAST-POCT za PCR detekcijo virusov influence A in B.FAST-POCT traja le 82 minut.Klinični testi s 36 vzorci nosnih brisov so pokazali dobro skladnost intenzivnosti fluorescence s standardno RT-PCR (Pearsonovi koeficienti > 0,9).Klinični testi s 36 vzorci nosnih brisov so pokazali dobro skladnost intenzivnosti fluorescence s standardno RT-PCR (Pearsonovi koeficienti > 0,9).Klinični testi s 36 vzorci mazkov iz nosu so pokazali dobro ustreznost intenzivnosti fluorescencije standardnega OT-PCR (Pirsonov koeficient > 0,9).Klinični testi s 36 vzorci nosnih brisov so pokazali dobro ujemanje z intenzivnostjo fluorescence standardne RT-PCR (Pearsonovi koeficienti > 0,9).RT-PCR Kliničnih preizkusov 36 vzorcev mazkov iz nosu je pokazalo dobro upad intenzivnosti fluorescencije s standardnim OT-PCR (Pirsonov koeficient > 0,9).Klinično testiranje 36 vzorcev nosnih brisov je pokazalo dobro ujemanje intenzivnosti fluorescence s standardno RT-PCR (Pearsonov koeficient > 0,9).Vzporedno s tem delom so različne nastajajoče biokemične metode (npr. toplotno kroženje plazme, imunski testi brez pomnoževanja in testi funkcionalizacije nanoteles) pokazale svoj potencial pri POCT.Vendar pa zaradi pomanjkanja popolnoma integrirane in robustne platforme POCT te metode neizogibno zahtevajo ločene postopke predhodne obdelave (npr. izolacijo RNK44, inkubacijo45 in pranje46), kar dodatno dopolnjuje trenutno delo s temi metodami za izvajanje naprednih funkcij POCT z zahtevane parametre.izhodna zmogljivost pridobivanja-v-odzivu.Pri tem delu, čeprav je zračna črpalka, ki se uporablja za aktiviranje ventila FAST, dovolj majhna, da jo je mogoče vključiti v namizni instrument (sl. S9, S10), še vedno porabi precej energije in ustvarja hrup.Načeloma je pnevmatske črpalke manjše oblike mogoče nadomestiti z drugimi sredstvi, kot je uporaba elektromagnetne sile ali aktiviranje s prstom.Nadaljnje izboljšave lahko vključujejo na primer prilagajanje kompletov za različne in specifične biokemične teste z uporabo novih metod odkrivanja, ki ne zahtevajo ogrevalnih/hladilnih sistemov, s čimer se zagotovi platforma POCT brez orodja za aplikacije PCR.Verjamemo, da glede na to, da platforma FAST zagotavlja način za manipulacijo s tekočinami, verjamemo, da predlagana tehnologija FAST predstavlja potencial za ustvarjanje skupne platforme ne le za biomedicinska testiranja, temveč tudi za spremljanje okolja, testiranje kakovosti hrane, sintezo materialov in zdravil ..
Zbiranje in uporabo vzorcev človeških nosnih brisov je odobril Odbor za etiko prve pridružene bolnišnice Zhejiang University (IIT20220330B).Zbranih je bilo 36 vzorcev nosnih brisov, ki so vključevali 16 odraslih < 30 let, 7 odraslih > 40 let ter 19 moških in 17 žensk.Zbranih je bilo 36 vzorcev nosnih brisov, ki so vključevali 16 odraslih < 30 let, 7 odraslih > 40 let ter 19 moških in 17 žensk.Zbranih je bilo 36 vzorcev mazkov iz nosu, v katerih je sodelovalo 16 odraslih < 30 let, 7 odraslih starejših od 40 let, 19 moških in 17 žensk.Šestintrideset vzorcev nosnih brisov je bilo zbranih pri 16 odraslih < 30 let, 7 odraslih nad 40 let, 19 moških in 17 žensk.Demografski podatki so predstavljeni v dodatni tabeli 3. Informirano soglasje je bilo pridobljeno od vseh udeležencev.Pri vseh udeležencih je obstajal sum na gripo in so se testirali prostovoljno brez nadomestila.
Podstavek in pokrov FAST sta izdelana iz polilaktične kisline (PLA) in natisnjena s 3D-tiskalnikom Ender 3 Pro (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Dvostranski lepilni trak je bil kupljen pri Adhesives Research, Inc. Model 90880. PET folija debeline 100 µm je bila kupljena pri McMaster-Carr.Tako lepilo kot PET folija sta bila razrezana z rezalnikom Silhouette Cameo 2 podjetja Silhouette America, Inc. Elastična folija je narejena iz materiala PDMS z brizganjem.Najprej je bil 200 µm debel PET okvir izrezan z laserskim sistemom in prilepljen na 3 mm debelo PMMA ploščo z uporabo 100 µm dvostranskega lepilnega traku.Prekurzor PDMS (Sylgard 184; del A: del B = 10:1, Dow Corning) smo nato vlili v kalup in s stekleno palico odstranili presežek PDMS.Po strjevanju pri 70 °C 3 ure je bilo mogoče 300 μm debel PDMS film odlepiti s kalupa.
Fotografije za vsestransko distribucijo, objavo na zahtevo in zanesljivo delovanje so posnete s hitro kamero (Sony AX700 1000 fps).Orbitalni stresalnik, uporabljen pri preizkusu zanesljivosti, je bil kupljen pri SCILOGEX (SCI-O180).Zračni tlak ustvarja zračni kompresor, za prilagajanje vrednosti tlaka pa se uporablja več digitalnih natančnih regulatorjev tlaka.Postopek testiranja obnašanja toka je naslednji.Vnaprej določena količina tekočine je bila vbrizgana v preskusno napravo in uporabljena je bila visokohitrostna kamera za snemanje obnašanja pretoka.Fotografije so bile nato vzete iz videoposnetkov obnašanja toka ob določenih časih, preostala površina pa je bila izračunana s programsko opremo Image-Pro Plus, ki je bila nato pomnožena z globino kamere za izračun prostornine.Podrobnosti o sistemu za preskušanje obnašanja pretoka lahko najdete na dodatni sliki S4.
V mešalno napravo za vialo vbrizgajte 50 µl mikrokroglic in 100 µl deionizirane vode.Fotografije mešane učinkovitosti so bile posnete z visokohitrostno kamero vsakih 0,1 sekunde pri tlakih 0,1 bara, 0,15 bara in 0,2 bara.Informacije o slikovnih pikah med postopkom mešanja je mogoče pridobiti iz teh slik s programsko opremo za obdelavo fotografij (Photoshop CS6).In učinkovitost mešanja je mogoče doseči z naslednjo enačbo 53.
kjer je M učinkovitost mešanja, N je skupno število vzorčnih slikovnih pik, ci in \(\bar{c}\) pa sta normalizirani in pričakovani normalizirani koncentraciji.Učinkovitost mešanja se giblje od 0 (0%, nemešano) do 1 (100%, popolnoma mešano).Rezultati so prikazani na dodatni sliki S6.
Komplet RT-PCR v realnem času za IAV in IBV, vključno z vzorci RNK IAV in IBV (kat. št. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Kitajska), pufer Tris-EDTA (št. pufra TE B541019 , Sangon Biotech, Kitajska), komplet za čiščenje RNK pozitivne kontrole (št. dela Z-ME-0010, Liferiver, Kitajska) in raztopina GAPDH (št. dela M591101, Sangon Biotech, Kitajska) sta komercialno na voljo.Komplet za čiščenje RNA vključuje vezavni pufer, pranje A, pranje W, eluent, magnetne mikrokroglice in akrilni nosilec.Kompleti IAV in IBV v realnem času RT-PCR vključujejo mešanico za odkrivanje nukleinske kisline IFVA in encim RT-PCR.Dodajte 6 µl AcrylCarrier in 20 µl magnetnih kroglic v 500 µl raztopine vezavnega pufra, dobro pretresite in nato pripravite raztopino kroglic.Dodamo 21 ml etanola izpiranjem A in W, dobro pretresemo, da dobimo raztopini izpiranj A oziroma W.Nato smo 18 µl fluorescentne PCR mešanice z IFVA nukleinsko kislino in 1 µl encima RT-PCR dodali v 1 µl raztopine TE, pretresali in centrifugirali nekaj sekund, tako da smo dobili 20 µl IAV in IBV primerjev.
Sledite naslednjemu postopku čiščenja RNA: (1) Adsorpcija RNA.Odpipetirajte 526 µl raztopine peletov v 1,5 ml centrifugalno epruveto in dodajte 150 µl vzorca, nato pa epruveto 10-krat ročno pretresite gor in dol.Prenesite 676 µl mešanice v afinitetno kolono in centrifugirajte 60 sekund pri 1,88 x 104 g.Naslednji odtoki se nato zavržejo.(2) Prva faza pranja.V afinitetno kolono dodajte 500 µl izpiralne raztopine A, centrifugirajte 40 s pri 1,88 x 104 g in zavrzite izrabljeno raztopino.Ta postopek pranja je bil ponovljen dvakrat.(3) druga stopnja pranja.Dodajte 500 µl izpiralne raztopine W v afinitetno kolono, centrifugirajte pri 1,88 × 104 g 15 s in zavrzite izrabljeno raztopino.Ta postopek pranja je bil ponovljen dvakrat.(4) Izpiranje.Dodajte 200 µl eluata v afinitetno kolono in centrifugirajte 2 minuti pri 1,88 x 104 g.(5) RT-PCR: eluat smo vbrizgali v 20 μl raztopine primerja v epruveti za PCR, nato pa smo epruveto postavili v testni aparat za PCR v realnem času (SLAN-96P), da smo izvedli postopek RT-PCR.Celoten postopek detekcije traja približno 140 minut (20 minut za čiščenje RNA in 120 minut za detekcijo PCR).
526 µl raztopine kroglic, 1000 µl raztopine za izpiranje A, 1000 µl raztopine za izpiranje W, 200 µl eluata in 20 µl raztopine primerja smo predhodno dodali in shranili v komorah M, W1, W2, E in detekcijskih komorah PCR.Montaža platforme.Nato je bilo 150 µl vzorca pipetirano v komoro M in platforma FAST-POCT je bila vstavljena v testni instrument, prikazan na dodatni sliki S9.Po približno 82 minutah so bili rezultati testa na voljo.
Če ni drugače navedeno, so vsi rezultati testa predstavljeni kot povprečje ± SD po najmanj šestih ponovitvah z uporabo samo platforme FAST-POCT in biološko neodvisnih vzorcev.Noben podatek ni bil izključen iz analize.Eksperimenti niso naključni.Raziskovalci med poskusom niso bili slepi za skupinske naloge.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek Nature Research Report, ki je povezan s tem člankom.
Podatki, ki podpirajo rezultate te študije, so na voljo v Dodatnih informacijah.Ta članek vsebuje izvirne podatke.
Chagla, Z. & Madhukar, P. Ojačevalci bolezni COVID-19 v bogatih državah bodo odložili cepiva za vse.Chagla, Z. & Madhukar, P. Ojačevalci bolezni COVID-19 v bogatih državah bodo odložili cepiva za vse.Chagla, Z. in Madhukar, P. Ojačevalci bolezni COVID-19 v bogatih državah bodo odložili cepiva za vse.Chagla, Z. in Madhukar, P. Ponovno cepljenje proti COVID-19 v bogatih državah bo odložilo cepljenje za vse.Narodna medicina.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. et al.Testiranje SARS-CoV-2 v državah z nizkimi in srednjimi dohodki: razpoložljivost in cenovna dostopnost v zasebnem zdravstvenem sektorju.mikrobna okužba.22, 511–514 (2020).
Svetovna zdravstvena organizacija.Globalna razširjenost in incidenca izbranih ozdravljivih spolno prenosljivih okužb: pregled in ocene.Ženeva: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM et al.Več 2D oblikovanih testnih trakov za stranski pretok.Aplikacija ASS.alma mater.Inter Milano.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM et al.Popolnoma zaprta mikrofluidna naprava za analizo na papirju.anus.Kemični.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. et al.Konkurenčna papirna imunokromatografija skupaj z encimsko modificiranimi elektrodami omogoča brezžično spremljanje in elektrokemijsko določanje kotinina v urinu.Senzorji 21, 1659 (2021).
Zhu, X. et al.Kvantificiranje biomarkerjev bolezni z vsestransko platformo lateralne tekočine, integrirano z nanocimi, z uporabo glukometra.biološki senzor.Bioelektronika.126, 690–696 (2019).
Boo, S. et al.Testni listič za nosečnost za odkrivanje patogenih bakterij z uporabo konkanavalina A-humanega horionskega gonadotropina-Cu3(PO4)2 hibridnih nanocvetov, magnetnega ločevanja in odčitavanja s pametnega telefona.Mikroračunalnik.Revija.185, 464 (2018).